为什么你的LC-MS/MS方法总是不稳定？-化学分析百科|合成百科|实验室咨询

为什么你的LC-MS/MS方法总是不稳定？

来源：本站 2025-12-19

导读：NO 1：方法开发的"标准流程"与"隐藏杀机正确姿势：用SciFinder、PubMed搜目标物+ "LC-MS/MS method development"，重点关注：质谱参数（ESI/APCI选择、离子对优化）

NO 1：方法开发的"标准流程"与"隐藏杀机

正确姿势：用SciFinder、PubMed搜目标物+ "LC-MS/MS method development"，重点关注：

质谱参数（ESI/APCI选择、离子对优化）
色谱柱类型（C18/HILIC选择逻辑）
前处理方法（蛋白沉淀/固相萃取的适用场景）

❌ 致命错误：直接复制文献方法，忽略基质效应差异！

案例：某次实验直接套用文献中的乙腈沉淀法，导致红细胞中待测物损失40%（文献是细胞上清液）

NO 2：质谱条件：离子对选择是"玄学"？不！

三步优化法

1）母离子扫描：用针泵进样，找到目标物最强信号离子（如m/z 291.1→255.3的睾酮）

2）子离子筛选：碰撞能量（CE）从15 EV开始，逐步增加，选响应值较高的前面3-5个离子对

3）优化DP，CE，补偿电压等参数

❌ 致命错误：离子对选择过少，只记录响应高的

比如，某些分析物的脱水峰往往响应较好，但实际分析时会有基线高，响应不稳定的问题。

NO 3：色谱条件：梯度洗脱的"魔鬼细节

梯度或等度

分析物较少，或分离较难，大胆的选择等度，记得冲洗色谱柱

分析物较多，或追求效率，大胆的选择梯度，记得足够的平衡时间

快速开发梯度条件

上来先用高有机相走两针，看分析物的保留情况，做到心中有数。

不推荐，使用所谓的标准梯度去分析，此类做法可以作为初入门的人员使用，但对于进阶阶段的而言，会带来效率变慢的问题。

准备两份样品

建议制备两份标准品：一个是确保溶解的高浓度样品，溶剂一定是分析物友好的（比如甲醇溶剂）。另一个是用水稀释一半的样品，比如50%甲醇水溶液。

使用上述两种样品进行分析方法的调整，会事半功陪。（简单来说，就是高有机相会可能有溶剂效应，可能不匹配样品制备条件。但，50%的有机相，可能带来标准品溶解度问题）。

添加剂玄学

非典型案例场景如下：

01）0.1%甲酸铵比0.1%甲酸，灵敏度高30%

02）乙酸比甲酸，灵敏度高一半

03）负离子模式加0.01%甲酸，响应高了60%

04）甲酸铵比乙酸铵，基线低40%……

NO 4：前处理选择

关于前处理，本号总结了很多资料，多是根据自身经验编写的，大家可自行搜索点击。比如下面的链接：

❌ 致命错误：选择了省钱的前处理方式

PPT最省钱，SPE较费钱。如果PPT能用，就不用SPE了？答案肯定是因地制宜的。

看一个来自中山医院的总结：文献报道的褪黑素检测质谱前处理方法较多，同一化合物的LC-MS检测可以通过不同的样品制备方法进行。

在研发过程中，我们尝试了2种不同的褪黑素样品制备方法，分别为蛋白沉淀法和固相萃取法。其中，蛋白沉淀法虽然成本更低，步骤更为简单，但性能验证结果显示处理后的样本对色谱柱的损耗较高，色谱柱使用寿命缩短，较短时间内即会出现超压情况。同时随着样本数增加，色谱峰会变宽而不符合积峰要求。此外，使用蛋白沉淀法处理后，定量和定性检测褪黑素的2个离子在结果差异很大，推测可能存在基质效应，不符合《液相色谱-质谱临床应用建议》及CLSI相关指南要求。因此，我们选择固相萃取板作为前处理方法，进一步去除杂质，富集浓缩待测物。固相萃取法制备的样本由于背景干净，没有出现蛋白沉淀法带来的问题，能够得到良好的色谱峰，且定量和定性检测的离子对结果接近，色谱柱使用状态正常。所以，我们最终选择了成本较高的固相萃取法作为前处理技术。

PS，其实我接触的褪黑素的检测，多有用PPT做的，还是要具体分析。

NO 5 ：方法验证闭坑指南

验证项目	通过标准	常见失败原因	改进方案
精密度（批内/批间）	CV＜15%	样本处理不一致	标准化SOP+自动化设备
基质效应	响应差异＜15%	未使用同位素内标	同位素校正
回收率	85%-115%	前处理步骤复杂	简化流程+复溶验证

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本文最后更新于2025-12-19 15:57:29，如果你的问题还没有解决，可以加入交流群和群友们一起讨论。

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