色谱柱类别

HPLC色谱柱主要分为四个主要模式：正相色谱（NPC）、反相色谱（RPC）、离子交换色谱（IEC）和体系排除色谱（SEC）。由于反相色谱在所有HPLC应用中占70-80%，因此针对小分子的反相色谱柱是本节讨论的重点。

色谱柱长度

色谱柱长度（L）决定了柱效( N )、分析时间和压力。

柱效（column efficiency），是指色谱柱维持某一化合物峰形而不使其扩散的能力。柱效与色谱柱的理论塔板数有关，理论塔板数越多，柱效越高，即得到色谱峰越尖锐，最终得到物质越纯。

理论塔板数（N）= L / H （在流速固定的情况下，理论塔板高度H为常数，因此理论塔板数N与长度成正比）。

下图演示了待测物在不同长度 ( L=15、30、50、75、150 mm）色谱柱上的TIC图。

值得注意的是，柱压也与色谱柱长度成正比。对于简单的混合物，较短的色谱柱可以获得足够的分辨率和较快的分析时间。典型的柱长范围为50~250mm，但较短的Fast LC柱（15 ~ 50 mm）使用量也在逐渐增加。

色谱柱填料特性

目前用于小分子分离的色谱柱填料的常见类型和特点概述如下。

载体种类：二氧化硅、聚合物、杂化物

二氧化硅是主要的载体材料，具有优异的物理和色谱性能，非键合二氧化硅色谱柱因具有较强的吸附特性而很少用于分析。二氧化硅表面硅羟基（Si-OH )可以与长链烷烃键合，得到C18，C8等非极性柱。硅羟基大部分都会参与键合反应，但仍会有一些硅羟基裸露在外面。这些硅羟基会与极性组分相互作用，使色谱峰出现拖尾分叉等现象。为了减少游离的硅羟基数目，通常会采用键合小分子的硅烷与之反应，这种技术叫做封端。一般采用封端技术的色谱柱，具有较高的重现性及耐久性，对于大多数的化合物都具有很好的分离能力。但该种色谱柱一般适用的pH范围为2~8。

聚合物载体材料如交联聚苯乙烯-二乙烯基苯、聚醚、聚甲基丙烯酸酯等已成功应用多年，多用于生物分离和离子交换色谱的载体。它们的强度和性能近年来有所改善，但在效率上仍落后于二氧化硅。主要优点是具有较宽的pH适用范围（1~14 ），且不含活性硅羟基。其他使用的材料包括氧化铝(多用于NPC或制备柱使用)和氧化锆( ZiO2 )，它们可以涂覆或粘合，以获得具有独特选择性和高温稳定性的稳定填料。

键合基团：C18，C8，C4，C3，胺基，氰基，苯基，极性嵌入（反相色谱）

下图展示了二氧化硅载体上的传统键合化学，通过将表面硅羟基与键合试剂（如二甲基辛基氯硅烷）反应形成一层疏水固定相。由于空间位阻效应，只允许键合效率达到50%，剩余硅羟基进一步与较小的硅烷（如三甲基氯硅烷）反应或"封端"。一些厂商可能会进行2次或3次封端以降低残留的硅羟基活性。类似地，其他键合试剂也可用于制备RPC、NPC和IEC的多种键合相(图3.7 )。图3.8为同一硅胶载体的5种不同键合相的选择性效果

色谱柱选择的一般准则

• C18- ：极疏水性、保留好、固定相稳定。为大多数分离的首选 。

• C8- ：C8具有与C18相似的选择性，但保留性要差得多。

• 氰基- ：保留性较C8弱，选择性与C8不同。值得注意的是，许多CN相的稳定性远不如C18。

• 苯基- ：适用于中极性化合物。对芳烃具有独特的选择性

• C3或C4- ：比C8或C18保留能力更弱。主要用于宽孔载体上的蛋白质分离。