一、验证目的

本试验的目的是为了有效的检测氟雷拉纳中4-甲酰-2-甲基苯甲酸甲酯和3,5-二氯溴苯的含量。产品中4-甲酰-2-甲基苯甲酸甲酯和3,5-二氯溴苯限度均为1.5ppm。根据此限度要求，对氟雷拉纳中4-甲酰-2-甲基苯甲酸甲酯和3,5-二氯溴苯的检测方法进行验证，验证内容包括系统适用性、专属性、检测限、定量限、线性及范围、准确度、精密度（重复性和中间精密度）、溶液稳定性和耐用性。

二、验证的方法

1. 仪器及参数

表1：仪器信息

表2：色谱条件

2. 试验材料

表3：试剂信息

表4：对照品信息

表5：样品信息

3. 溶液配制

空白溶液（稀释剂）：乙腈；

对照品贮备液一：取4-甲酰-2-甲基苯甲酸甲酯和3,5-二氯溴苯各约0.02g，精密称定，置20ml量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀；精密移取上述溶液1.0ml，置20ml量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得；（每1ml中含4-甲酰-2-甲基苯甲酸甲酯和3,5-二氯溴苯各约50μg）

对照品贮备液二：精密移取对照品贮备液一1.0ml，置50ml量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得；（每1ml中含4-甲酰-2-甲基苯甲酸甲酯和3,5-二氯溴苯各约1μg）

对照品溶液：精密移取对照品贮备液二1.0ml，置100ml量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得；（每1ml中含4-甲酰-2-甲基苯甲酸甲酯和3,5-二氯溴苯各约10ng）

供试品溶液：取供试品约0.06g，精密称定，置10ml量瓶中，加稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。（每1ml中约含氟雷拉纳6mg）

4. 进样程序及系统适用性要求

表6：进样程序及系统适用性要求

5. 计算公式

按外标法以峰面积计算供试品中各杂质的含量：

式中：

f—各杂质对照品的响应因子，ng/ml；

m₁—各杂质对照品的称样量，g；

ρ—各杂质对照品的含量，%；

m₂—供试品的称样量，g；

V₁—对照品溶液的稀释体积，ml；

V₂—供试品溶液的稀释体积，ml；

A₁—对照品溶液中各杂质的峰面积；

A₂—供试品溶液中各杂质的峰面积。

6. 可接受标准

供试品中，含4-甲酰-2-甲基苯甲酸甲酯和3,5-二氯溴苯均不得过1.5ppm。

三、验证内容

1. 系统适用性

1.1溶液配制

空白溶液、对照品贮备液一、对照品贮备液二、对照品溶液同“二、验证的方法”项下“3.溶液配制”的方法配制。

1.2进样程序

空白溶液分析1次，对照品溶液1分析5次，对照品溶液2分析2次。

1.3可接受标准

连续分析5次对照品溶液1，各杂质峰面积的RSD值应不得过10.0%，保留时间的RSD值应不得过1.0%；7针对照品溶液各杂质f值的RSD值应不得过10.0%。

2. 专属性

2.1溶液配制

空白溶液、对照品溶液、供试品溶液同“二、验证的方法”项下“3.溶液配制”的方法配制；

供试品加标溶液（100%限度水平）：取供试品约0.06g，精密称定，置10ml量瓶中，加入对照品溶液使溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。

2.2进样程序

空白溶液、供试品溶液、对照品溶液、供试品加标溶液各分析1次。

2.3可接受标准

空白溶液对各杂质的测定无干扰；对照品溶液色谱图中，各杂质峰与相邻峰之间的分离度应符合要求；供试品加标溶液色谱图中，各杂质峰与相邻峰之间的分离度应符合要求，各杂质峰的保留时间应与对照品溶液色谱图中相应峰的保留时间一致。

3. 检测限和定量限

3.1概述

以限度浓度的10%浓度水平作为方法的检测限，考察其信噪比是否符合要求。以限度浓度的30%浓度水平作为方法的定量限，考察其信噪比及重复性是否符合要求。

3.2溶液配制

对照品溶液同“二、验证的方法”项下“3.溶液配制”的方法配制；

检测限溶液（10%）：精密量取对照品溶液1.0ml，置10ml量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得；配制1份；

定量限溶液（30%）：精密量取对照品溶液3.0ml，置10ml量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得；平行配制6份。

3.3进样程序

检测限溶液分析3次、6份定量限溶液各分析1次。

3.4可接受标准

检测限溶液中，各杂质峰的信噪比不得小于3。

定量限溶液中，各杂质峰的信噪比不得小于10；峰面积的RSD值应不得过15.0%。

4. 线性及范围

4.1概述

在限度浓度（100%）的上下取5个比较均匀的浓度点（30%、50%、100%、150%、200%）进样分析，以各杂质的浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，进行线性回归。

4.2溶液配制

对照品贮备液二、对照品溶液同“二、验证的方法”项下“3.溶液配制”的方法配制；

各线性溶液的配制见下表7。

表7：线性溶液配制

4.3进样程序

5个线性溶液各分析1次。

4.4计算方式

以各个线性溶液中各杂质的浓度为横坐标，对应的峰面积为纵坐标，做线性回归方程，报告线性曲线的斜率、截距和相关系数r。

4.5可接受标准

各杂质线性回归方程的相关系数r≥0.990，Y轴截距不得大于100%浓度响应因子的0.25倍。

5. 精密度（重复性）

5.1概述

由同一试验人员配制2份供试品溶液、6份供试品加标溶液，进行供试品加标溶液重复性测试，计算6份供试品加标溶液中各杂质的回收率及回收率的RSD值。

5.2溶液配制

空白溶液、对照品溶液、供试品溶液同“二、验证的方法”项下“3.溶液配制”的方法配制；

重复性溶液：取供试品约0.06g，精密称定，置10ml量瓶中，加入对照品溶液使溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。平行配制6份。

5.3进样程序

空白溶液分析1次、对照品溶液1分析5次、对照品溶液2分析2次、2份供试品溶液各分析1次、6份重复性溶液各分析1次。

5.4可接受标准

6份重复性溶液中，各杂质的回收率应在75%～120%之间，回收率的RSD值应不得过10.0%。

6. 精密度（中间精密度）

6.1概述

由不同的试验人员，于不同日期，配制6份供试品加标溶液（100%限度稀释剂平），进行供试品加标溶液中间精密度测试。

6.2溶液配制

空白溶液、对照品贮备液一、对照品贮备液二、对照品溶液、供试品溶液等同“二、验证的方法”项下“3.溶液配制”的方法配制；

中间精密度溶液同“5.精密度（重复性）”项下“重复性溶液”的方法配制，平行配制6份。

6.3进样程序

空白溶液分析1次、对照品溶液1分析5次、对照品溶液2分析2次、2份供试品溶液各分析1次、6份中间精密度溶液各分析1次。

6.4可接受标准

6份中间精密度溶液中，各杂质的回收率应在75%～120%之间，回收率的RSD值应不得过10.0%。与重复性6次结果，共12次供试品加标溶液中，各杂质回收率的RSD值应不得过15.0%。

7. 准确度

7.1概述

准确度是通过回收率来反映。通过在供试品溶液中加入30%、100%、150%三个不同限度浓度的对照品溶液，每个浓度平行制备3份，分别测定其含量，将实测值与理论值比较，计算回收率，并计算9份回收率数据的相对标准偏差（RSD）。

7.2溶液配制

空白溶液、对照品溶液、供试品溶液等同“二、验证的方法”项下“3.溶液配制”的方法配制；

30%线性溶液、150%线性溶液同“4.线性及范围”项下相应溶液的方法配制；

准确度溶液1（30%）：取供试品约0.06g，精密称定，置10ml量瓶中，加入30%线性溶液使溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。平行配制3份；

准确度溶液2（100%）：取供试品约0.06g，精密称定，置10ml量瓶中，加入对照品溶液使溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。平行配制3份；

准确度溶液3（150%）：取供试品约0.06g，精密称定，置10ml量瓶中，加入150%线性溶液使溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。平行配制3份。

7.3进样程序

空白溶液分析1次、对照品溶液1分析5次、对照品溶液2分析2次、2份供试品溶液各分析1次、9份准确度溶液各分析1次。

7.4计算公式

式中：

f—各杂质对照品的响应因子，ng/ml；

C₁—各杂质对照品溶液的配制浓度，ng/ml；

C₂—各准确度溶液中供试品的浓度，mg/ml；

C₃—供试品溶液中供试品的浓度，mg/ml；

A₁—各准确度溶液中各杂质的峰面积；

A₂—供试品溶液中各杂质的峰面积。

7.5可接受标准

9份准确度溶液中，各杂质的回收率应在75%～120%之间，回收率的RSD值应不得过15.0%。

8. 溶液稳定性

8.1概述

取对照品溶液、供试品溶液和供试品加标溶液，室温放置，分别于不同时间点取样检测，考察对照品溶液、供试品溶液和供试品加标溶液在室温条件下的稳定性。

8.2溶液配制

对照品溶液、供试品溶液同“二、验证的方法”项下“3.溶液配制”的方法配制；

供试品加标溶液：取供试品约0.06g，精密称定，置10ml量瓶中，加入对照品溶液使溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。

8.3进样程序

在不同时间点取对照品溶液、供试品溶液和供试品加标溶液各分析1次。

8.4可接受标准

对照品溶液、供试品溶液和供试品加标溶液在一定时间内稳定（该时间内取样检测的对照品溶液、供试品溶液和供试品加标溶液中各杂质峰面积与0小时比较，各杂质峰面积的比值应在75%～120%之间）。（备注：供试品溶液中检测得到的各杂质峰面积如均低于检测限的峰面积，可直接判定为溶液稳定）

9. 耐用性

9.1概述

考察在色谱条件有微小的变动时，测定结果不受影响的承受程度，为所建立的方法用于日常检验提供依据，对对照品溶液、供试品溶液和供试品加标溶液进行分析，考察系统适用性和回收率是否符合要求，各耐用性色谱条件见下表8。

表8：耐用性色谱条件

9.2溶液配制

空白溶液、对照品溶液、供试品溶液同“二、验证的方法”项下“3.溶液配制”的方法配制；

供试品加标溶液：取供试品约0.06g，精密称定，置10ml量瓶中，加入对照品溶液使溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。

9.3进样程序

各条件下，空白溶液分析1次、对照品溶液1分析5次、对照品溶液2分析2次、供试品溶液分析1次、供试品加标溶液分析1次。

9.4可接受标准

在各种不同的耐用性实验条件下，系统适用性应符合要求；各杂质的回收率应在75%～120%之间，回收率的RSD值应不得过15.0%。

四、样品检验

按照“二、验证的方法”项下所述方法，对氟雷拉纳中4-甲酰-2-甲基苯甲酸甲酯和3,5-二氯溴苯的含量进行测定，记录色谱图，根据“二、验证的方法”项下计算公式计算各批供试品中4-甲酰-2-甲基苯甲酸甲酯和3,5-二氯溴苯的含量。