头孢菌素类药物是以天然头孢菌素 C作为原料，经过半合成改造其侧链而得到的一类抗菌药物，也是目前临床应用最广泛的一类 抗菌药物。

头孢孟多酯钠和盐酸头孢替安属于第二 代头孢菌素类药物，对革兰阴性杆菌所产生的的 β- 内酰胺酶的稳定性较第一代头孢菌素强，临床上用 于呼吸系统、皮肤和软组织、骨和关节、泌尿系统等 感染，

头孢地嗪钠属于第三代头孢菌素，对革兰阳性 菌及革兰阴性菌具广谱抗菌作用，临床用于敏感菌 所致的下呼吸道、泌尿系感染。为了考察头孢孟多酯钠、盐酸头孢 替安、头孢地嗪钠原料药中是否含有常见的 N-亚硝 胺类基因毒性杂质，

保障药品的质量安全，建立了一个 GC-MS /MS 同时测定头孢 孟多酯钠、盐酸头孢替安、头孢地嗪钠中 8 种常见的 N-亚硝胺类基因毒性杂质的方法，与样品直接溶解 后进样的方法相比，对仪器污染少，干扰小，

可用于监测和控制这 3 种头孢菌素类药物中 N-亚硝胺类 基因毒性杂质。

1 仪器与试剂 

1.1 仪器 GC-MS/MS气质联用仪( 美国安捷伦 公司，配备液体自动进样器) ，CPA2250 型电子天平 ( 梅特勒-托利多公司) ，Vortex-3 型涡旋混合器( 德 国 IKA 公司) 。

1.2 试药 N-亚硝基二甲胺( NDMA) 对照品( 批号: PLSBI，99．9%) ，N-亚硝基二乙胺( NDEA) 对照品( SIGMA，批号: 049K1613，100%) ，N-亚硝基二丙胺( NDPA) 对照品( TCI，批号: 049K1613，100%) ，N-亚硝基 二 丁 胺 ( NDBA) 对 照 品 ( TCI，批 号: S47KJ-IT， 97.0%) ，N-亚硝基甲基乙基胺 ( NMEA) 对 照 品 ( CHEM SERVICE，批号: 8309900，99.5%) ，N-亚硝 基 吡 咯 烷 ( NPYR ) 对 照 品 ( SIGMA，批 号: MKCB3427，99%) ，N-亚 硝 基 哌 啶 ( NPIP ) 对 照 品 ( CHEM SERVICE，批号: 7377900，99．5%) ，N-亚硝 基吗 啉 ( NMOR) 对 照 品 ( TCI，批 号: MBSPF-GB，99.0%) 甲醇为色谱纯，氢氧化钠、二氯甲烷均为分 析纯。头孢孟多酯钠样品( XXX股份有限公司，批号: 2007101、2007102、2007103) 、盐酸头孢替安( XXX股份有限公司，批号: 2007110、 2007111、2007112) 、头孢地嗪钠(XXX股份有限公司，批号: 2002101、2002102、2002103) 。

2 方法与结果

2.1 仪器条件

2.1.1 GC 条件 色谱柱: Agilent VF-WAX ms( 30 m× 0．25 mm，0．25 μm) ，

  进样口温度: 250℃，

   脉冲不分流 进样;  

   程序升温条件: 50℃，保 持 1 min，以 15℃ · min^－1 的速率升温至 100℃，保持 1.5min，再以 5℃ · min^－1 的速率升温至 115℃，保持 1min，在以 20℃ · min^－1 的速率升温至 200℃，保持 2 min，后运行

230℃， 保持 4 min; 流速: 1．0 ml·min^－1 。

2.1.2 MS 条件 采用 EI 源，电压为 70 eV，接口温 度 280℃，离子源温度 250℃，四极杆温度 150℃，溶 剂延迟 5 min，MRM 模式，检测离子见表 1。

2.2 溶液的配制

2.2.1 对照品储备液 精密称取 NDMA、NMEA、 NDEA、NDPA、NDBA、NPIP、NPYR、NMOR 各适量，分 别加甲醇溶解并稀释制成浓度分别为 1.0670， 1.0310，1.0530，1.0170，0.9970，1.0930，1.0290 mg ·ml^-1的溶液。

混合对照品储备液 A: 精密量取上述 8 个杂质单标溶液各0．5 ml置同一 50 ml 量瓶中，加甲 醇稀释至刻度摇匀。在精密量取0.5 ml置10 ml量瓶 中，加0.1 mol·L^－1 的氢氧化钠溶液稀释至刻度，摇 匀。

混合对照品储备液 B: 精密量取1 ml混合对照品 储备液 A 置10 ml 量瓶中，0．1 mol·L^－1 的氢氧化钠溶 液稀释至刻度，摇匀。 

2.2.2 对照品溶液 精密量取混合对照品储备液 B 15，60，150 μl，混合对照品储备液 A 30，60，150，300 μl，分别置 15 ml 刻度离心管中，各加0．1 mol·L^－1 氢 氧化钠溶液稀释至 5 ml，混匀，

得到溶液的浓度分别 约为0.15，0.6，1.5，3，6，15，30 ng·ml ^－1 。于这些离心管分别精密加入 2 ml 二氯甲烷，涡旋混合 2 min，静置分层，取下层溶液作为对照品溶液。

2.2.3 供试品溶液 精密称取样品约0.25 g置15 ml 离心管中，加入0．1 mol·L^－1 氢氧化钠溶液适量，涡 旋使样品完全溶解，再加氢氧化钠溶液至5 ml，混 匀，精密加入 2 ml 二氯甲烷，涡旋 2 min，静置分层， 取下层溶液作为供试品溶液。

2.3 测定方法学验证 

2.3.1 专属性试验 精密量取混合对照品储备液 A 30 μl，按“2.2.2”项下方法制备 3 ng·ml ^－1 的对照品 溶液; 精密称取头孢孟多酯钠、盐酸头孢替安、头孢 地嗪钠各0.25 g样品，分别置于 15 ml 刻度离心管 中，

精密加入混合储备对照品溶液 A 30 μl，按照 “2.2.3”项下方法溶解并萃取制备得到样品加标溶 液; 取0．1 mol·L^－1 氢氧化钠溶液 5 ml，同法制备得 到空白溶液。取上述空白溶液、样品加标溶液及对 照品溶液、供试品溶液分别进样测定，

记录的 TIC 色 谱图见图 1，结果空白溶液无干扰，3 种样品溶液中 也无杂质干扰，8 个亚硝胺杂质分离良好，峰型好， 满足系统适用性的要求。

2.3.2 进样重复性 取“2．3．1”项下的对照品溶液 连续进样 6 针，记录 8 个杂质峰定量离子的峰面积， 计 算 NDMA、NMEA、NDEA、NDPA、NDBA、NPIP、 NPYR、NMOR 的 峰 面 积 RSD 分 别 为2．4%，1．9%， 2．5%，2．1%，2．0%，2．7%，2．5%，2．5% ( n = 6) ，表明 进样重复性良好。 

2.3.3 线性关系考察 取“2．2”项下线性对照品溶 液分别进样测定，记录 8 个杂质峰定量离子的峰面 积，分别 以 峰 面 积 A 为 纵 坐 标，以 浓 度 ( C，ng · ml ^－1 ) 为横坐标，得到回归方程和相关系数。结果见 表 2。表明 8 个亚硝胺杂质在各自的浓度范围内线 性关系良好。

2．3．4 定量限和检出限 取混合对照品储备液 B 采用0.1 mol·L^－1 氢氧化钠溶液逐级稀释，再精密量 取 5 ml 分别加入到约0.25 g样品中，按 2．2 项下方 法制备得到供试品溶液分别进样测定，当被测峰的 S /N 达到 10 左右时测得

NDMA、NMEA、NDEA、NDPA、NDBA、NPIP、NPYR、NMOR 的最低定量浓度分 别为0．16，0．15，0．16，0．16，0．15，0．10，0．16，0．11 ng· ml －1 ，

即定量限分别为 0.0032，0.0030，0.0031， 0.0032，0.0031，

0.0021，0.0033，0.0022 μg·g^－1 ; 当被测 峰 的 S /N 达 到 2 ～ 3 左 右 时 测 得 NDMA、 NMEA、NDEA、NDPA、NDBA、NPIP、NPYR、NMOR 的最低检出浓度为0.053，0.050，0.052，0.053，0.051， 0.031，

0.055，0.033 ng·ml ^－1 ，即检出限为0.0011， 0.0010，0.0010，0.0011，0.0010，0.0006，0.0011， 0.0007 μg·g^－1 。

2.3.5 精密度试验 精密称取头孢孟多酯钠样品 ( 批号: 2007101) 、盐酸头孢替安( 批号: 2007112) 、 头孢地嗪钠样品( 批号: 2002103) 各 6 份，约0．25 g， 按“2．1”项下供试品溶液制备方法制备得到溶液分 别进样测

定，结果 8 个亚硝胺杂质均未检出。另精 密称取上述 3 个样品 6 份，约0．25 g，分别精密加入 30 μl 混合对照品储备液 A，按“2．2”项下方法制备 得到供试品溶液分别进样测定，结果头孢孟多酯钠 中 NDMA、

NMEA、NDEA、NDPA、NDBA、NPIP、 NPYR、NMOR 的 含 量 RSD 分 别 为 1.4%，2.1%， 1.8%，2.6%，3.1%，1.9%，3.5%，2.3%; 盐酸头孢替安 中 NDMA、NMEA、NDEA、NDPA、NDBA、NPIP、

NPYR、NMOR 的 含 量 RSD 分 别为 3．5%，2．7%，2．3%，3．2%，4．2%，2．7%，2．4%，3．4%; 头孢地嗪钠中 NDMA、NMEA、NDEA、NDPA、NDBA、NPIP、NPYR、 NMOR 的含量 RSD 

分别为3．5%，3．0%，3．9%，3．3%，3．2%，3．5%，3．7%，3．1%( n = 6) 。

2.3.6 回收率试验 精密称取头孢孟多酯钠样品 ( 批号: 2007101) 、盐酸头孢替安( 批号: 2007112) 、 头孢 地 嗪 钠 样 品 ( 批 号 为 2002103 ) 各 9 份，约 0．25 g，其中 3 份分别精密加入 60 μl 混合对照品储 备液 B，

3 份分别精密加入 30 μl 混合对照品储备液 A，3 份分别精密加入 150 μl 混合对照品储备液 A， 按“2．2”项下供试品溶液制备方法制备得到低、中、 高回收率测试溶液 ( 分 别 相 当 于 0.012，0.06， 0.3 μg·g^－1

浓度水平) ，分别进样测定，记录色谱图 与峰面积，计算 8 个亚硝胺杂质的回收率，结果在 低、中、高浓度的平均回收率均在85.5% ～ 110% 之 间，RSD 均≤4．8%( n = 9) 。 2．4 样品含量测定 取头孢孟多酯钠样

品( 批号: 20076101、2007102、2007103) 、盐酸头孢替安样品 ( 批 号: 2007110、 2007111、2007112 ) 、头孢地嗪钠样品 ( 批 号: 2002101、2002102、2002103) ，按“2．2”项下的方法制 备供试品溶液分别进样测定，

按标准曲线法以峰面积计算，结果上述样品各 3 批均未检出 8 种亚硝胺杂质。

3 讨论

3．1 测定方法的选择 8 个 N-亚硝胺杂质的沸点在 157 ～ 237℃ 之间， 沸点较高，如采用顶空进样法即使采用较高的加热温度，各物质的灵敏度仍然较低，难以达到痕量检测的灵敏度要求，因此没有选择顶空法进行测定。

头孢孟多酯钠、盐酸头孢替安、头孢地嗪钠均易溶于水、氢氧化钠溶液，其它常见溶剂均无法同时溶解 3 种样品，然而水并不是一种好的气相色谱用溶剂，相 对于其他有机溶剂的灵敏度低，峰型差，

如采用水溶 液直接溶解上述样品后进样检测，水进入气相色谱 仪后还会对色谱系统造成损害，此外高浓度的样品 溶液多次进样之后容易污染进样口的衬管和色谱 柱，缩短色谱柱的寿命，样品在进样口高温状态

下可能降解产生某些杂质，导致一些偶然误差的出现，因 此本文没有采用直接溶解进样的方法。

从实验中，采用从水溶液萃取测定 NDMA 和 NDEA 时，二氯甲烷是最理想的萃取剂，经试验发 现，8 种亚硝胺杂质均易溶于二氯甲烷，当采用二氯 甲烷去萃取含 8 种亚硝胺杂质的水溶液时，萃取效果较为理

想，而头孢孟多酯钠、盐酸头孢替安、头孢 地嗪钠均不易溶于二氯甲烷，因此尝试采用萃取法 进行测定。 

3．2 供试品溶液制备方法的确定根据文献，NDMA 在碱性水溶液中采用有机 溶剂的提取率较高，因此尝试采用不同浓度的氢氧化钠溶液来溶解样品。取头孢孟多酯钠、盐酸头孢 替安、头孢地嗪钠样品0.25 g分别

采用1．0，0．5，0．2，0．1 mol·L^－1 氢氧化钠溶液 5 ml 在常温下进行溶解 性试验，结果表明，不同浓度的氢氧化钠溶液均能够 完全溶解头孢孟多酯钠、盐酸头孢替安、头孢地嗪钠 3 种样品，1 mol·L^－1 氢氧

化钠溶液溶解时溶液颜色呈黄色，当0．1 mol·L^－1 氢氧化钠溶液溶解时溶液颜 色呈淡黄或浅黄色，氢氧化钠溶液的浓度越高溶液 的颜色越深，表明碱浓度过高易造成药物成分降解， 为了避免药物降解产生杂质

干扰，选择0．1 mol·L^－1 氢氧化钠溶液来溶解样品。 

最终选择的条件是，取0．25 g样品，加入0．1 mol ·L^－1 氢氧化钠溶液适量，涡旋使完全溶解，稀释至 5 ml，混匀，精密加入 2 ml 二氯甲烷，涡旋混合 2 min， 静置分层，取下层溶液作为供试品溶液。

3．3 本文检测的 8 种 N-亚硝胺类杂质中 NDMA 和 NDEA 被世界卫生组织的致癌物清单列为 2A 类致 癌物质，NMEA、NDPA、NDBA、NPIP、NPYR、NMOR 被列为 2B 类致癌物质。

根据国家药品监督管理局药审中心发布的《化学药物中亚硝胺类杂质研究技 术指导原则( 试行) 》的要求，为了保证药品的安 全，药品上市许可持有人/药品生产企业应对药品的 安全和质量进行生命周期管理，

尽可能避免亚硝胺 类杂质的引入，若确不能完全避免，应充分评估风 险，并将亚硝胺类杂质水平控制在安全限度以下。 关于亚硝胺类杂质产生的原因，根据指导原则有多 种产生原因，可能是工艺步骤中使用了

能引入仲胺和亚硝基化试剂的物料，可能是生产过程中使用 了被亚硝胺杂质污染的物料，也可能是药物降解产 生( 如雷尼替丁) 。此外文献［7］也显示，药物中 NDMA 和 NDEA 的来源可能是生产过程中原料、

中间 体或有机溶剂( 例如生产缬沙坦使用的 N，N-二甲基 甲酰胺) 中含有的微量二甲胺或二乙胺和亚硝酸盐 在酸性条件下反应产生。头孢孟多酯钠、盐酸头孢 替安和头孢地嗪钠均为半合成头孢菌素药物，其中

头孢孟多酯钠和盐酸头孢替安都含有四氮唑结构， 头孢地嗪钠也含有氮杂环，使用的物料可能会引入 容易产生亚硝胺类物质的成分或被亚硝胺杂质污 染，因此有必要对 N 亚硝胺类杂质进行筛查和质量 控制。

 本方法中 NDMA、NMEA、NDEA、NDPA、NDBA、 NPIP、NPYR、NMOR 等 8 种亚硝胺杂质的定量限均达到0.003 3 μg·g^－1 及以下，灵敏度能够满足杂质 控制的限量要求。本方法灵敏度高，回收率均符合

要求，方法简便可靠，能够控制 3 种头孢类药物中 8 种亚硝胺类杂质的限量。